Klíčová práce CCMB na programovaném oživení buněk nabízí naději na regenerativní medicínu

Landmarková studie indických vědců nejen zjistila, že se buňky zotavují z fáze blízké smrti, ale také zjistila molekulární mechanismus, který řídí proces zotavení, opak programované buněčné smrti. Vědci v Centru pro buněčnou a molekulární biologii (CSIR-CCMB), Hyderabad, nazývají mechanismus přežití, který odkryli jako „naprogramované oživení buněk“. „Zde jsme objevili geneticky kódovaný kód pro oživení, který jsme jmenovali programované oživení buněk, který umožňuje buňkám zotavit se ze stavu blízké smrti,“ Dr. Santosh Chauhan, vedoucí výzkumný pracovník CCMB a odpovídající autor a publikovaný papír v Embo Journal říká.

Naprogramovaná buněčná smrt je obecně považována za nevratný proces. V posledních letech však vědci zjistili, že některé formy buněčné smrti mohou být za určitých podmínek skutečně obráceny. Studie vědců CCMB vedená Dr. Santosh Chauhan poprvé odhalila klíčové molekulární mechanismy, které regulují zvrácení buněčné smrti.

Serendipity

The first signs of Programmed cell revival of cells were discovered by accident when Kautilya Kumar Jena, who was a PhD student about six years ago and now at BRIC-Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, added a sublethal dose of a death-inducing agent (L-leucyl-L-leucine methyl ester — LLOMe) added to cause lysosome-mediated cell death in a petri dish, which led k oživení buněk místo toho, aby způsobovalo smrt. Buňky, které jsou připojeny k povrchu destičky, se oddělí a přicházejí na povrch a ukazují prvky podobné buněčné smrti. „Buňky se nejen oddělí, ale také vykazují vlastnosti, které naznačují, že buněčná smrt skutečně začala, jako je vyboulení buněčných membrán (blebbing). Cesta k buněčné smrti se zdá být spáchána. Takže vědci v tomto stádiu za předpokladu, že buňky jsou mrtvé,“ Dr. Chauhan. „Cesta k buněčné smrti není omezena na fenotypové, ale také molekulárně. Viděli jsme mnoho molekulárních projevů buněčné smrti, jako jsou mitochondrie narušení nebo rozpadu.“

Ačkoli proces buněčné smrti začal, ale nebyl proveden v plném rozsahu, protože byla použita pouze subletální dávka činidla vyvolávajícího úmrtí. Pouhých pět minut po léčbě činidlem indukujícím úmrtí začaly buňky proces apoptózy, jak se zobrazují buňkami, které se stávají kulatým. O třicet minut později se buňky začaly oddělit od růstové plochy a buněčné membrány se začaly vypouknout (blebbing), což je pokročilé stadium buněčné smrti. Namísto dalšího postupu směrem k naprogramované buněčné smrti se během dvou tří hodin namísto 80-90% buněk místo toho znovu připojilo k povrchu a za šest hodin znovu získalo jejich normální morfologii. A 16 hodin po léčbě činidlem indukujícím úmrtí se buňky zdály normální a zahájily proces rozdělení. Zbývající stopy abnormality zmizely za 24 hodin a buňky vypadaly morfologicky normální.

Podle literatury je 4-8 milimolár činidla indukujícího úmrtí považováno za dostatečné k zabíjení buněk. „Zjistili jsme však, že při této koncentraci se proces buněčné smrti iniciuje, ale není zcela proveden. Proces buněčné smrti pak zaujme U-otočení a buňky nezemřou, ale odrazí se, když se použije subletální koncentrace činidla, což je opravdu zajímavé,“ vysvětluje Dr. Chauhan. Vědci zjistili, že buňky se mohou zotavit, i když je integrita plazmatické membrány ohrožena, ale ne po narušení jaderné membrány. Zjistili, že resuscitace z buněčné smrti byla vysoce regulovaným, dobře programovaným procesem.

Stát se buňkami podobnými kmeni

Vědci zjistili, že iniciace programované buněčné smrti ve skutečnosti způsobuje, že buňky zvrátí z diferencovaného stavu do de-diferencovaného stavu, více než odhalení zvrácení buněčné smrti. „Buňky se zdají být de-diferenciované, něco jako embryonální kmenové buňky. Když buňky začnou zemřít, přeprogramují se tak, že se v nich začnou objevovat charakteristiky podobné kmenovému, a pak nezemřou,“ říká. „Protože buňky nezemřou, zdá se, že zvrácení buněčné smrti převádí plně diferencovanou buňku na embryonální kmenové buňky s potenciálem regenerovat a potenciál k uzdravení.“

Obrácení z diferencovaného stavu na de-diferenciované kmenové buňky nebylo zjištěno na základě samotných morfologických charakteristik, ale také molekulárně. „Provedli jsme celé genomové sekvenování RNA a epigenomové studie, abychom zjistili, že dospělé, diferencované buňky se resetují a stávají se buňkami podobnými kmeni,“ říká Dr. Chauhan. „Data naznačují, že oživující buňky spustí molekulární program napodobující embryonální buňky pro znovuobjevení nového života,“ píšou.

Hojení ran na kůži

Jakmile vědci pozorovali, že molekulárně se zdá, že buňky vypadají jako kmenové, pokračovaly v testování regenerační kapacity buněk, které byly ošetřeny pomocí subletální dávky činidla indukujícího buněk. Nejprve vědci testovali schopnost činidla vyvolávajícího úmrtí (LLOME) při zrychlení hojení ran na kůži v modelu myši.

Činidlo indukující buněčnou smrt bylo rozpuštěno ve vodě, aby se získala koncentrace 4 a 8 miliomolárních, a voda byla lokálně aplikována na povrch rány dvakrát denně. Zvířata ošetřená vodou obsahující LLOME se ve srovnání s kontrolní skupinou „výrazně rychlejší“ zahojí. Při jediném dni léčby bylo průměrné zmenšení velikosti rány 27% ve 4 milimolární skupině a asi 50% v 8 milimolární skupině, zatímco kontrolní skupina vykazovala pouze 3% hojení. Třetí den byla průměrná velikost rány snížena o 64% a 78% ve 4 miliolárních a 8 milimolárních skupinách, ve srovnání s pouhými 23% hojení v kontrolní skupině.

Hojení ran rohovky

Po ochutnali úspěch u modelu rány myší a vědci testovali účinnost subletální dávky činidla pro zabíjení buněk při poškození hojení rohovky. Spolupráce s Dr. Kiranem Kumarem Bokarou z CCBM, který studuje modely poškození rohovky, vědci testovali hojení ran rohovky v režimu myši. Epitel rohovky jednoho oka byl záměrně poškozen jemným škrábáním epitelu rohovky a popáleninou alkalií produkované lokální aplikací hydroxidu sodného sodného. Čícel indukující buněčnou smrt (LLOME) byl podáván lokálně dvakrát denně po dobu sedmi dnů.

Došlo k „významnému snížení“ epiteliální defektu od druhého dne ve skupině léčené LLOME ve srovnání s kontrolní skupinou. „Zjistili jsme, že opětovné epitelizace, což je druh regenerace epiteliálních buněk, byla ve skupinách ošetřených LLOME velmi rychlá a dramaticky lepší,“ říká Dr. Chauhan. Výsledky ukazují, že agent by se mohl ukázat jako silná terapeutická možnost léčby poranění popálení rohovky.

Regenerace ocasu pulcového ocasu

„Byli jsme více povzbuzováni výsledky hojení ran rohovkových ran. Protože hojení ran a hojení ran rohovky omezí na povrch, chtěli jsme otestovat skutečný regenerační potenciál,“ říká. Za tímto účelem se obrátili na zavedený model regenerace ocasu Tadpole. Ve spolupráci s Dr. Pravati Kumari Mahapatrou z Utkal University, Bhubaneswar, vědci testovali účinnost LLOME při zrychlení regenerace pulcového ocasu v asijských stromových žábou (Polypedates maculatus) model. Ocasy asijských žabů stromů byly amputovány a poté ošetřeny pomocí čtyř různých dávek vody obsahující LLOME. Pozorovali rychlý blastina (shluk nediferencovaných buněk, které se tvoří v místě poranění a mají schopnost regenerovat na tvorbu orgánu nebo přívěsku) v ošetřené skupině do 24 hodin po amputaci. Studie zjistila, že léčba různými koncentracemi LLOME vedla k „významně zrychlené“ regeneraci ocasu ve srovnání s kontrolní skupinou. „V případě tadpolů ošetřených subletální koncentrací LLOME činidla se ocasy regenerovaly o pět šest dní dříve než kontrolní skupina,“ říká Dr. Chauhan. „Udělali jsme několik molekulárních experimentů, abychom pochopili, co se děje v ocasu během regenerace, a zjistili jsme, že činidlo LLOME pracovalo prostřednictvím lysosomů.“

Regenerace axonů

V dalším testu na ověření regenerační kapacity subletální dávky Llome Agent vědci ve spolupráci s Dr. Anindya Ghosh-Roy z Národního mozkového výzkumného střediska (NBRC), Manesar, Haryana, testovali účinnost agenta při indukci regenerace axonů v C. elegans. A zjistili, že délka opětovného opětovného opětovného ošetření byla „výrazně zvýšena“ při léčbě LLOME. Kromě toho se funkční obnova také po léčbě „významně“ zlepšila.

Zvýšení hematopoetických kmenových buněk

Konečně ve spolupráci s Dr. Rohanem Jayant Khadilkar z Advanced Center pro léčbu, výzkum a vzdělávání v rakovině (ACTREC), Tata Memorial Center, Bombaj, testovali vědci, když byli vystaveni kmenové povaze buněk, když byli vystaveni subletální dávce Llome Agenta. Larvy ovocných mušek byly léčeny činidlem buněčné smrti při subletální koncentraci (8 milimolárních) po dobu 14 hodin. Ovocné mouchy vykazovaly „výrazné zvýšení“ v hematopoetických kmenových a progenitorových buňkách v lymfatických žlázách po ošetření LLOME.

„Tyto nové poznatky o molekulárních mechanismech programovaného oživení buněk mají slibné terapeutické důsledky a zároveň otevírají nové pokyny pro experimentální zkoumání,“ říká a Novinky a Zobrazit článek Ve stejném čísle časopisu.

„Lékařský slib je obrovský, od rychlejšího zotavení po mrtvici nebo srdečním infarktu až po regeneraci tkání u degenerativních onemocnění. Místo nahrazení poškozených orgánů by lékaři mohli jednoho dne přimět tělo, aby se uzdravil tím, že se probudil tento skrytý program,“ říká. „Tento průlom otevírá novou kapitolu v buněčné biologii a rozmazává hranici mezi smrtí a opravou a naznačováním budoucnosti, kde se uzdravení zevnitř.

Slovo opatrnosti

„Ale je tu také varování. Rakovinné buňky mohou využívat stejný oživovací program, aby odolával léčbě a návratu silnějšího,“ varuje. Vypracovávání újmy, které taková léčba může způsobit u lidí, kteří mají rakovinu, říká: „Rakovinné terapie zabíjejí nádorové buňky. Ale chemoterapie nebo radioterapie však může být suboptimální vedoucí k relapsu rakoviny. Cítíme relaps, který by mohl být způsoben tím, že by se objevil postupem, který se objevil. V suboptimálních dávkách, které mohou být plně zabíjeny, je možné plně zabíjet, což je možné, aby se napájely, což je v ideálním případě, že je to, že je to, že je to, že je to, že je v plně zabíjených, což je v ideálním případě, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je v plnějším, což je v ideálním případě, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je to, že je v plném rozsahu. Tento proces v kombinaci s terapiemi rakoviny může být klíčem ke snížení relapsu rakoviny, “říká.