Nová metoda může pomoci lépe posoudit přesnou technologii úpravy genomu

Vědci a lékaři mohou lépe posoudit přesnou technologii úpravy genomu pomocí nové metody, kterou dnes zveřejnila Dětská výzkumná nemocnice St. Jude. Značné množství času a zdrojů vynaložených na vylepšení technologie úpravy genů CRISPR se zaměřuje na identifikaci malých míst mimo cíl, která představují bezpečnostní riziko, což je také technicky náročné. Badatelé St. Jude řešili problém tvorbou Cirkularizace pro vysoce výkonnou analýzu nukleázových genomových efektů pomocí editorů sekvenační báze (CHANGE-seq-BE), nezaujatá, citlivá a na zdroje efektivní metoda k nalezení těchto úprav mimo cíl. Překonal konvenční přístupy a již byl použit pro podporu klinické práce. Technika byla zveřejněna v Přírodní biotechnologie.

Zatímco tradiční technologie úpravy genomu využívá CRISPR-Cas9 k vyříznutí malého segmentu DNA z genomu, vědci pokračovali ve vývoji přesnějších verzí, včetně editorů bází, které mohou najít a nahradit jednotlivé páry bází DNA.

Vyvinuli jsme CHANGE-seq-BE, abychom vědcům umožnili lépe porozumět základním editorům, důležité třídě přesných genomových editorů CRISPR. Je to jednoduchý a efektivní způsob, jak porozumět globální aktivitě základních editorů, který umožňuje výzkumníkům vybrat vysoce specifické a aktivní editory a cílové kombinace pro výzkum nebo terapii.“

Shengdar Tsai, PhD, korespondent, Ústav hematologie St. Jude

CHANGE-seq-BE se již přijímá na podporu klinického výzkumu. Dnes zveřejněný dokument obsahuje případovou studii nouzové aplikace do Food and Drug Administration (FDA) pro základní editor pro léčbu CD40L-deficientního X-linked Hyper IgM (X-HIGM) syndromu. X-HIGM je genetické imunitní onemocnění, které může být upraveno úpravou základny. CHANGE-seq-BE dokázala potvrdit 95,4% cílovou specificitu z použitého základního editoru, aniž by došlo k významné mimocílové aktivitě, a poskytla cenné bezpečnostní údaje, které pomohou posunout léčbu pacienta vpřed.

„Byla to opravdu vzrušující aplikace na podporu naléhavé žádosti FDA o rychlé ošetření pacienta,“ řekl Tsai. „Je příkladem toho, jak tato metoda umožňuje rychlé pochopení toho, co tito editoři dělají v genomu, a pomáhá rozvíjet slibná aktivní a specifická terapeutika.“

Kombinace efektivity s nezaujatým přístupem poskytuje lepší výsledky

Tsaiova laboratoř vytvořila CHANGE-seq-BE, protože konvenční metody hodnocení bezpečnosti základních editorů si musely vybrat mezi komplexním pokrytím a efektivním využíváním zdrojů. Některé techniky pro komplexní nalezení necílové aktivity úpravy báze nezaujatým způsobem vyžadují sekvenování celého genomu, což může být neúměrně drahé a časově náročné. Alternativně některé techniky předem vybírají podezřelé cíle mimo cíl, aby prováděly méně sekvenování a šetřily zdroje, ale tyto zkreslené techniky nikdy nemohou detekovat neočekávané úpravy mimo cíl. Vědci ze St. Jude navrhli CHANGE-seq-BE tak, aby zachytil to nejlepší z obou přístupů: komplexní řešení, které by bylo také efektivní z hlediska zdrojů.

Chcete-li tak učinit, CHANGE-seq-BE začíná celým genomem, ale místo toho, aby jej okamžitě sekvenovali, vědci rozdělili genom na malé kruhy DNA. Poté vezmou tyto kruhy a vystaví je základnímu testovanému editoru. Poté ošetřují DNA speciálním enzymem, který detekuje, zda došlo k úpravě báze, a otevírají tyto – a pouze ty – kruhy DNA s důkazem úpravy báze do lineárních vláken. Lineární řetězce DNA jsou pak selektivně sekvenovány, což vyžaduje mnohem méně zdrojů než konkurenční techniky. Optimalizovali jej pro oba hlavní typy editorů bází (editory báze adeninu a cytosinu). Po vyvinutí metody chtěli vědci vědět, zda je skutečně komplexnější a efektivnější z hlediska zdrojů než konvenční přístupy, a tak je testovali přímo.

„Když jsme to přímo porovnali s jinými metodami, CHANGE-seq-BE našel téměř všechna místa nominovaná těmito metodami, stejně jako mnoho, které byl výhradně schopen detekovat,“ řekl Tsai. „Ukázali jsme, že tento nezaujatý přístup byl citlivější při použití pouze asi 5% čtení sekvencí.“

Vzhledem k citlivosti techniky, snadnému použití a efektivnímu využití zdrojů ji již začali používat jiní. Kompletní experimentální protokoly a software umožňující CHANGE-seq-BE jsou popsány ve studii, což umožňuje toto přijetí. Například kromě klinické aplikace uvedené v tomto článku klinické studie v St. Jude a mimo ni začlenily tuto techniku ​​do svého plánování a použily ji jako nástroj pro hodnocení bezpečnosti a účinnosti. CHANGE-seq-BE byla také nedávno použita k charakterizaci prvního specifického pro pacienta naživu ošetření úpravy genomu. Laboratoře fundamentálního výzkumu, které zkoumají základní úpravy, jej také začaly používat k testování mimo cíle v rané fázi svého procesu, přičemž lépe identifikují nejslibnější přístupy, které je třeba sledovat, než stávající obrazovky. Tito první uživatelé ukazují přitažlivost této techniky pro výzkumníky i klinické lékaře a její příslib posouvat budoucnost základních úprav.

„Umožnili jsme těm, kteří vyvíjejí tyto terapie, rychle pochopit a najít základní editory s nejvyšší potenciální aktivitou a specifičností,“ řekl Tsai. „Doufáme, že metody jako CHANGE-seq-BE otevřou dveře k dalším terapiím upravujícím genom, které jsou vyvíjeny pro pacienty, kteří je potřebují.“