Nový test rozlišuje mezi prionovou chorobou a jinými příčinami rychle progresivní demence

V květnu 2024 zahájila Mayo Clinic nový test prionů, RT-quic Prior, CSFkteré mohou odlišit onemocnění prionů od jiných příčin rychle progresivní demence – zejména autoimunitní formy demence a rychle progresivní formy Alzheimerovy choroby.

„Rychle progresivní demence jsou formy demence, kde pacient přechází od prvního nástupu symptomů ke ztrátě funkční nezávislosti, obvykle za méně než dva roky,“ říká John Mills, Ph.D., spoluzakladatel klinické neuroimunologické laboratoře Mayo Clinic.

V raných stádiích rychle progresivních demenů pacienti často vykazují nespecifické příznaky, které dosahují dosažení a Definitivní diagnóza náročný. Je však zásadní identifikovat správnou příčinu co nejdříve, protože některé formy – jako jsou ty poháněné autoimunitními procesy – mohou být léčitelné, zatímco jiné ne.

„Je opravdu důležité být schopen poskytnout pacientovi rychlou diagnózu a přesnou diagnózu,“ říká Dr. Mills. „Protože pokud je to léčitelné, budete to chtít hned zacházet.“

Člověk onemocnění prionůTaké se nazývá Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), vyplývá z nesprávného složení normálního prion Protein – základní protein přítomný u všech. Nesprávná forma proteinu, příčina CJD, se může objevit kvůli základní genetické mutaci, která predisponuje protein k nesprávnému složení nebo spontánní chyby při skládání proteinů.

Nesprávný protein může vyvolat samoobslužný cyklus tím, že způsobí správně složené prionové proteiny k přijetí patogenní formy. Postupem času tento proces vede k smrti neuronů. Bohužel neexistuje lék.

Až donedávna bylo laboratorní testování CJD omezeno na nespecifické markery neuronální degenerace. Tyto testy mohou detekovat a potvrdit rychlé ničení mozkových tkání dochází, ale nemohou s jistotou říci klinickým lékařům základní příčinu.

S vývojem rt-quic (nebo “v reálném čase Konverze vyvolaná třeskem „) Test pro onemocnění prionů, kliničtí lékaři byli poprvé schopni získat diagnostický výsledek testu specifický pro onemocnění prionů s velmi vysokou diagnostickou přesností. Předtím, než byl tento test k dispozici, by to nebylo, dokud nebyla pitva úplná, že příčina by mohla být s jistotou identifikována.

Učinit nebezpečného agenta bezpečnému pracovat s

RT-quic prion, CSF (mozková míšní tekutina) je jediným definitivním klinickým testem svého druhu, který nezahrnuje biopsii mozku.

„Mnoho laboratoří, které původně provedly toto testování, začalo s mozkovými homogenáty, a tak když mluvíte o přímé práci s mozkovými tkáněmi, existuje jasné riziko přenosu například v případech jehly,“ říká Dr. Mills.

Naštěstí byla prokázána jako citlivá RT-quic pro onemocnění prionů pomocí vzorků CSF, což je vzorek s nízkým rizikem a může být manipulován ve standardní klinické laboratoři, která pracuje na úrovni biologické bezpečnosti 2 (BSL-2). Abychom však zajistili další vrstvu bezpečnosti, cílem na Mayo Clinic bylo provést toto testování v laboratoři BSL-2+, což znamenalo, že ze základů musel být postaven speciální laboratorní prostor.

„Vytvoření správného prostoru pro tento test bylo složité,“ říká Ellen Lexvold, technický specializovaný koordinátorka v Neuroimunologické laboratoři, který pomohl vybudovat novou testovací laboratoř.

„Bylo to jako budování letadla, když ho létáte. Museli jsme přizpůsobit pracovní postup ke zvláštním úvahám, jako jsou konstruované bezpečnostní ovládací prvky, plynulé podlahové dlaždice, ocelové stoly odolné proti korozi (Bleach je jedna z mála látek, které mohou inaktivovat patogenní prionové proteiny), negativní tlakový proud vzduchu a vzduchový proud.“

Grizzly Bear Country

Testování prionů je tak jedinečné, že před vývojem Mayo v klinickém testu RT-quic existovala pouze jedna další laboratoř, která nabízela test, a pouze hrstka laboratoří provádějících test po celém světě.

Místo narození RT-Quic je Rocky Mountain Laboratories (RML), výzkumné zařízení, které se nachází v malém městě Montana v Hamiltonu, zaklíněné mezi horskými pásy Bitterroot a Sapphire na malebné krajině.

„V roce 2010 RML oznámila použití testu zvaného RT-Quic v památkovém papíru,“ říká Dr. Mills.

„Ukázali, jak tento test dokázal detekovat velmi malé množství patogenního prionového proteinu a mohly by tyto prionové proteiny amplifikovat in vitro a detekovat je s velmi vysokou citlivostí. To byl poprvé, kdy byl test, který byl specifický pro prionovou onemocnění, dostatečnou citlivost, aby byl považován za potenciální diagnostický test na onemocnění prionu.“

V roce 2018 cestovali do Hamiltonu Dr. Mills, Lexvold a Matt Roforth, vedoucí vývojář pro laboratorní medicínu a patologii Mayo Clinic, aby se naučili, jak provést test.

Tým strávil týden v RML, který je kvůli svému výzkumu specializace na vektorových chorob a vznikající infekční choroby jednou z mála laboratoří v USA, které má hodnocení BSL-4, což je požadavek na umístění věcí, jako je Ebola. RML je biomedicínské výzkumné zařízení National Institutes of Health (NIH).

„Zařízení je obklopeno v oplocení ostnatého drátu, bezpečnostních bran a než vstoupíte, musíte provést kontrolu na pozadí,“ říká Dr. Mills.

„Každé ráno, když jsme vešli dovnitř, museli jsme projít bezpečnostní kontrolní stanoviště. Prohlédněte si vaše věci, procházíte detektorem kovů. Z dobrého důvodu byla velmi těsná bezpečnost, protože sídlí vysoce nakažlivé a nebezpečné patogeny.“

RML je zcela zvláštní o používání technologie RT-quic a bude ji učit pouze na místě. Dr. Mills pokračuje: „Chtějí vědět, že kdokoli, kdo dělá testování, to dělá správně. Procházejí vás skrz své protokoly, chtějí vás sledovat, jak provedete některé testování, takže si jsou jisti, že to víte, jak to udělat.“

Přímo z filmu

Během ráno a časných odpoledních hodin na RML se tým naučil špičkové technologie a navázala spojení, která by jim pomohla zahájit tento test na Mayo. „Pak to nemělo mnoho společného s naším volným časem,“ říká Dr. Mills. „Takže bychom šli na turistiku po hořkách Bitterroot, abychom si věci prohlédli.“

Často také skončili u místní večeře, kde všichni znali všichni a majitel se zdvojnásobil jako kuchař. Podle Dr. Millse byla celá zkušenost „hned z filmu“. Ve skutečnosti byly části televizního seriálu „Yellowstone“ natočeny v Hamiltonu a okolí.

Dr. Mills také vypráví: „Setkali jsme se s některými renomovanými a uznávanými vědci, kteří se přestěhovali do Hamiltonu, aby pracovali v RML, často z celého světa. Ne přesně ten typ lidí, které byste očekávali, že budou užitečné s brokovnicí, ale měli medvědy a nejrůznější divoká zvířata přicházející do jejich domovů.“

Když se tým vrátil do Rochesteru, museli počkat, než bude vybudován nový laboratorní prostor, než se mohou vyvinout test – prostor, který vytvořili „laboratoř Bitterroot Lab“ na počest své zkušenosti v Montaně. Vývoj klinicky ověřené verze prionového testu trvalo více než dva roky (díky pandemickému přerušení).

„Museli jsme vzít něco, co bylo skutečně určeno pro výzkum, a museli jsme to aktualizovat, museli jsme to rozšířit, abychom udrželi krok s propustností pracovního postupu klinického prostoru,“ říká Lexvold.

„V laboratořích Rocky Mountain se všechno děje ručně. Takže někdo přímo pipetoval vzorek. Přidávají své agenty do každé studny. Je to velmi manuální test. Udělali jsme něco jiného. Podívali jsme se na jiné robotické, automatizované instrumentaci, které bychom mohli použít k tomu, abychom dělali vše, co pipety nemusely, takže to nemuselo být manuální.“

Dr. Mills dodává: „Chtěli jsme malý systém, který byl malý, aby se mohl ve skutečnosti hodit do skříňky na biologickou bezpečnost, protože jsme nechtěli, aby se tyto vzorky manipulovaly a smíchaly se všemi činidly mimo kabinet biologické bezpečnosti. Takže to byla výzva. Ale náš laboratorní personál skutečně posílil a přijali výzvu a věřili ve vizi, aby nabídli test na Mayo Clinic.“

Zaměstnanci pracovali s prodejcem, který měl kus vybavení s malou stopou, která po některých úpravách bude fungovat uvnitř skříně biologické bezpečnosti.

Jack Wu, Ph.D., nyní člen klinické chemie, vyvinul a ověřil test. „V zásadě berete pacientovo CSF, smíchejte jej s rekombinantním substrátovým prionovým proteinem, který byl vyroben na mayo kliniku, a fluorescenční barvivo, které označuje proteinové agregáty generované v reakci,“ říká.

„Tuto desku inkubujete při teplotě 55 stupňů Celsia a třesete ji určitými činidly. Pro fluorescenci měří každých 45 minut a dělá to po dobu 36 hodin.

„Nejkritičtější složkou tohoto testu je produkce vysoce kvalitních proteinů substrátu, která stanoví základ pro vynikající výkon testu při detekci některých vzácných podtypů onemocnění lidských prionů. Metodika RT-quic je první svého druhu v Mayo.“

Doba obratu pro výsledek testu je menší než týden, což není malý čin vzhledem k tomu, jak specializovaná je RT-quic. „Smělým vtipem bylo, že RT-Quic nebyl tak rychlý,“ říká Dr. Mills. „Ale myslím, že k tomu měníme postoje.“

Definitivní odpověď namísto léku

Část důvodu, proč Mayo prošel všemi těmito potížemi, aby se tento test dostal, je, dosud byla v USA pouze jedna další laboratoř, která provedla klinickou verzi testu: Národní patologické středisko pro patologii prionových chorob (NPDPSC), laboratoř v Clevelandu v Ohiu, také trénovala RML.

NPDPSC byl založen CDC v důsledku vyděšení onemocnění šílených krav, ke kterému došlo před mnoha lety, na sledování této hrozby onemocnění v budoucnosti.

„Problém je, že nejsou tradiční referenční laboratoř,“ říká Dr. Mills. „Nabízejí test prionů, ale jedním z našich obav bylo, že jejich doba obratu (pro výsledek testu) je dlouhá. Nefungují v normálních průmyslových standardech referenční laboratoře, kde máte 24/7 laboratorní pokrytí, včetně svátků.

„Věděli jsme, že bychom mohli poskytnout rychlejší čas obratu, inovovat kolem této technologie a zvýšit dostupnost tohoto testování prostřednictvím laboratoří Mayo Clinic Laboratories.“

Dr. Mills pokračuje: „Kromě toho se Mayo Clinic snaží nabídnout jednorázový obchod pro diagnostické testování. Tento test se pěkně hodí k této filozofii. Naši pacienti čekali dlouho na diagnostické odpovědi. A nutnost čekat na ně a jejich rodinu.“

Nyní pacienti vykazující příznaky rychle progresivní formy demence mohou rychle získat definitivní odpověď s vysoce citlivým testem. Toto malé pohodlí je to, co přimělo kliniku Mayo, aby poslala tým do Montany, vytvořilo zcela nový laboratorní prostor a automatizoval složitý výzkumný test pro klinické použití.

„V klinické laboratoři se muselo stát hodně těžkého zvedání, protože tento test je velmi jedinečný od všeho, co děláme,“ říká Dr. Mills.

„Ale klinika Mayo a naši lidé mají historii podpory složitých projektů, i když se zdají být skličující, zejména pokud existuje příležitost zlepšit péči o pacienty.“