Zebrafish odhaluje, jak dva geny nezávisle řídí regeneraci smyslových orgánů

Vědci odhalí, jak zebrafish přepíná mezi buněčným dělením a přímé diferenciací k obnově smyslových orgánů a zpochybňuje dlouhodobě pohledy na regeneraci tkání.

Studie: Proliferace kmenových a progenitorových buněk je nezávisle regulována cyklindskými geny specifickými pro typ buněk. Obrázek kredit: Anusorn Nakdee / Shutterstock.com

V nedávné studii zveřejněné v časopise Přírodní komunikaceVědci v Stowers Institute for Medical Research v USA zkoumali mechanismy, kterými geny kmenových buněk modulují regeneraci v neuromastech laterální linie zebrafish (smyslové orgány). Konkrétně studie využila špičkové editace genů CRISPR, sekvenování RNA s jedním buňkami a živé zobrazování, aby prozkoumala, jak dva odlišné geny cyklin D, CCNDX a CCND2ARegulujte odlišné buněčné populace během vývoje a regenerace těchto smyslových orgánů.

Zjištění studie to odhalí CCNDX a CCND2A Funkce prostřednictvím nezávislých, ale komplementárních cest – bývalý moduluje dělení progenitorových buněk, zatímco druhý řídí amplifikaci proliferace kmenových buněk. I když je ztracena jedna cesta, druhá může částečně kompenzovat, ale regenerace probíhá prostřednictvím omezeného a méně robustního mechanismu. Například v CCNDX Přímé diferenciace může generovat vlasové buňky bez dělení; Vyskytuje se však méně buněk a výrazný defekt polarity, přičemž přibližně 70% regenerovaných vlasových buněk vykazuje zadní zkreslení. Tato vada polarity je mechanicky spojena se sníženou expresí hes2.2který obvykle brání Emx2hlavní regulátor polarity vlasových buněk. Tyto geny společně zajišťují robustní udržování tkáně a nabízejí nové terapeutické směry pro výzkum smyslové regenerace.

Pozadí

Tkáňový obrat a regenerace jsou základními procesy nezbytnými pro udržení života. Tyto neustále se vyskytující procesy spoléhají na jemné rovnováhy mezi populacemi kmenových buněk, které se v průběhu času postupně doplňují, a progenitorové buňky, které dozrávají do specializovaných forem v reakci na fyziologické požadavky.

Desetiletí výzkumu odhalilo, že proteiny cyklin D, známé primárně pro svou klíčovou roli při regulaci progrese buněčného cyklu, mají podstatné modulační účinky na buněčnou proliferaci. Bohužel mechanistické souvislosti mezi specifickými populacemi kmenových buněk a používáním proteinu cyklinu zůstávají špatně pochopeny. Rozmotání těchto asociací může otevřít dveře novým regenerativním terapiím, zejména v dnešní stále více stárnoucí globální populaci, která zažívá pokles smyslových schopností.

Cílem nedávného výzkumu je využít zebrafish, dobře studovaný modelový organismus proslulý jeho regenerační schopnosti, aby na tuto otázku odpověděl. Zejména je známo, že zebrafisova smyslová laterální linie regeneruje buňky rychle po poranění. Tato linie se skládá z vlasů, podpory a plášťových buněk, nezbytných pro detekci pohybu vody. Vzhledem k jejich funkční analogii s lidským vnitřním uchem se tyto modely používají k lepšímu pochopení smyslové regenerace.

O studii

Tato studie využila několik transgenních kmenů zebrafish larválních kmenů k objasnění mechanismů, které jsou základem regenerace v smyslovém systému laterální linie. Studie se zaměřuje na dva geny cyklin D: CCNDX a CCND2A.

Využitím CRISPR-CAS9 a CRISPR-CAS12A Editace genů, transgenní zebrafish s CCNDX a/nebo CCND2A Vyřazeny byly poté pozorovány (přes ScRAN-seq), aby se objasnily jejich rozdíly v genové expresi a buněčných stavech. Tyto testy byly replikovány přes 10 000 buněk a byly doplněny modelováním rychlosti RNA pomocí algoritmů abstrakce grafu (PAGA) založené na Scvelo a oddílu.

Vědci začali léčbou larev zebrafish neomycinem, antibiotikem (ototoxinem), který spustí rychlou smrt vlasů (a následnou regeneraci) podél bočního liniového orgánu. Pozorování prostřednictvím testů s jednobuněčným RNA-Seq (ScRNA-seq) v kombinaci s 5-ethynyl-2′-deoxyuridinem (EDU) značením a časově prostupování (Nikon Ti2 Eclipse; 42 hodin při 28,5 ° C) vedlo k identifikaci dvou proliferačních buněk jaderné buňky antigen (PCNA) Populace buněk označených expresními, které se řídí CCNDX a druhý CCND2A.

Nakonec bylo provedeno modelování proteinů pomocí robetta a mol*3D divákových platforem za účelem porovnání strukturální ochrany proteinů cyklinu napříč transgenními druhy zebrafish. Statistické analýzy zahrnovaly analýzu rozptylu (ANOVA) a t-testů pro rozdíl mezi léčbou významné vykazování (P <0,05).

Nálezy studie

Testy léčby neomycinu odhalily přítomnost dvou nezávislých buněčných populací zapojených do regenerace neuromastů. Analýza ScRAN-SEQ tyto populace odhalila: 1. Samoficiální zesilující populace kmenových buněk, které exprimují CCND2Aa 2. progenitorové buňky, které dozrávají do smyslových vlasových buněk, které exprimují CCNDX.

Zejména, CCNDX kmeny knockout prokázaly regeneraci vlasů i při nepřítomnosti CCNDX výraz. Přesto byly tyto vlasové buňky často zdobené, možná kvůli změně hes2.2 a Emx2 aktivita (geny zapojené do polarity vlasových buněk). Důležité je, že vyjádření CCND2A pod CCNDX Promotor, umělá genetická záchrana, dokázal obnovit počet i orientaci vlasových buněk v CCNDX-Mutanti (p <0,0001), označující mechanistickou demonstraci spíše než fyziologickou kompenzaci.

Naproti tomu CCND2A-Mutanty s deficitem vykazovaly sníženou amplifikační proliferaci kmenových buněk během vývoje, ale regenerace byla méně ovlivněna, což naznačuje, že jiné cykliny mohou kompenzovat během opravy tkáně, aniž by indukovaly defekty polarity. Konkrétně studie hlásí upregulaci CCND1 během regenerace v CCND2A mutanti, potenciálně kompenzovat ztrátu CCND2A funkce (doplňkový obrázek 5N – P). Tato nezávislá regulace naznačuje, že smyslová regenerace může nastat, i když je ohrožena jedna populace (cesta). Například pět dní po oplodnění (DPF), CCNDX Mutanty vykazovaly signifikantně snížené EDU+ diferenciační progenitorové buňky ve srovnání s jejich sourozenci divokého typu (p = 0,0001), zatímco amplifikace počtu buněk zůstala nezměněna (p = 0,35).

Toto zjištění, že vlasové buňky zebrafish se mohou regenerovat prostřednictvím přímé diferenciace bez proliferace progenitoru, představuje posun paradigmatu v regenerativní biologii a zpochybňuje dlouhodobý pohled, že proliferace je nezbytná pro regeneraci tkáně.

Nakonec tato studie odhalila důležitost „notchové signalizace“ při smyslové regeneraci. Bylo zjištěno, že tato vysoce konzervovaná komunikační cesta k buňkám, nezbytná pro vývoj a tkáňovou homeostázu, potlačuje CCNDX exprese, s jeho inhibicí vede ke zvýšené proliferaci progenitorů pouze v CCNDX-Intaktujte ryby, čímž potvrzují těsnou regulační smyčku mezi aktivitou zářezu, expresí cyklinu a regenerační kapacitou.

Závěry

Tato studie představuje významný pokrok v našem chápání regenerativní biologie, což poprvé prokazuje, že na rozdíl od předchozích předpokladů nejsou všechny proliferující buňky v regenerativních tkáních regulovány podobně. Zdůrazňuje budoucí význam regulace buněčného cyklu na míru, využívá obojí CCNDX a CCND2A Pro optimální výsledky smyslové regenerace.

Tato zjištění by mohla urychlit vývoj terapií v regenerativní medicíně. Je však důležité si to poznamenat CCNDX chybí u savců, takže tato zjištění jsou přímo použitelná pouze pro druhy ne-sammálních. Stejně jako u všech základních vědeckých studií na zvířecích modelech by měla být nálezy zvážena v souvislosti s biologií zebrafish a jejich použitelnost vůči lidem bude vyžadovat další výzkum.